Un microscope puissant capture les protéines motrices avec des détails sans précédent

Amanda Heidt est rédactrice et rédactrice indépendante à Moab, dans l'Utah.

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Illustration de moteurs moléculaires appelés kinésines sur un microtubule.Crédit : Graham Johnson, Ron Vale/HHMI

Presque dès qu'il y a eu des microscopes à super résolution, les scientifiques les ont dirigés vers des moteurs moléculaires appelés kinésines. Ces protéines, alimentées par le carburant moléculaire ATP, pilotent des processus cruciaux, notamment la division cellulaire, la signalisation cellulaire et le transport intracellulaire en faisant la navette entre les cargaisons le long des autoroutes protéiques appelées microtubules. Les chercheurs ont longtemps voulu comprendre le fonctionnement de ces moteurs, mais pour les visualiser, les scientifiques ont dû les ralentir ou les isoler dans des systèmes in vitro simplifiés.

Maintenant, dans des articles publiés simultanément dans Science, deux équipes travaillant indépendamment ont utilisé un outil de super-résolution appelé MINFLUX pour étudier le moteur en temps quasi réel à des concentrations d'ATP physiologiquement pertinentes. Le premier article, dirigé par l'inventeur du MINFLUX, Stefan Hell, qui a une nomination conjointe à l'Institut Max Planck (MPI) pour les sciences multidisciplinaires à Göttingen et au MPI pour la recherche médicale à Heidelberg, tous deux en Allemagne, a utilisé une nouvelle conception d'instrument pour suivre la protéine en 3D, révélant des détails sur son mouvement1. La seconde, dirigée par le biophysicien Jonas Ries du Laboratoire européen de biologie moléculaire à Heidelberg, a montré pour la première fois que MINFLUX est capable de suivre la kinésine même au milieu de l'agitation des cellules vivantes2.

"Cette technologie nécessite beaucoup de choses différentes pour fonctionner, et c'est amusant de voir toutes ces choses se réunir", déclare Michelle Digman, ingénieure biomédicale à l'Université de Californie à Irvine, qui développe des stratégies d'imagerie mais n'a été impliquée ni dans l'un ni dans l'autre. étude. "Cela semblait être une preuve de concept pour montrer qu'ils sont capables de suivre très précisément la kinésine. Et quand vous avez le système de cellules vivantes, c'est encore plus spectaculaire."

Les chercheurs ont commencé à travailler sur les bases du mouvement de la kinésine peu de temps après la découverte de la protéine en 1985, mais l'avènement des outils de super-résolution a apporté un nouveau niveau de détail. En 2004, des chercheurs ont utilisé une technique appelée FIONA (imagerie par fluorescence avec une précision d'un nanomètre) pour montrer que la kinésine, qui ressemble à une tige haute et tordue portant des chaussures surdimensionnées, marche "main sur main" sur sa piste de microtubules, déplaçant son pieds dans un mouvement semblable aux mains d'un enfant lorsqu'ils traversent un ensemble de barres de singe3. Mais, bien que FIONA ait fourni une résolution spatiale exceptionnelle, les scientifiques ont dû rationner l'ATP pour ralentir suffisamment la protéine pour l'étudier. Au cours de la dernière décennie, les chercheurs ont marqué la kinésine avec des billes de germanium4 ou d'or5 pour la suivre, mais ces balises relativement volumineuses laissent planer un doute sur la capacité des méthodes à récapituler l'amplitude complète des mouvements de la protéine.

Lorsque Hell et son équipe ont introduit6 MINFLUX en 2016, il y voyait une avancée par rapport à son prédécesseur, la microscopie à épuisement des émissions stimulées (STED), pour laquelle Hell a partagé le prix Nobel de chimie 2014. STED utilise un laser « d'appauvrissement » en forme de beignet superposé à un laser d'excitation pour réduire efficacement la zone de fluorescence en dessous de la limite de diffraction conventionnelle de la lumière (environ 250 nanomètres). MINFLUX, en revanche, utilise un laser en forme de beignet pour créer un point d'intensité de fluorescence nulle en son centre. En déplaçant ce laser, les chercheurs peuvent localiser l'emplacement d'une molécule fluorescente à des vitesses quasi physiologiques.

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Dans la nouvelle étude1, publiée en mars, le groupe Hell a testé une version de MINFLUX qui pulse des lasers linéaires dans deux directions dans le plan focal en succession rapide, localisant la protéine en trouvant où les intensités de fluorescence qui se chevauchent sont les plus faibles. En combinant plusieurs mesures, les chercheurs ont pu produire des traces qui montrent où la molécule se déplace le long du microtubule, comme une application qui trace le chemin d'un coureur.

Bien que le nouveau MINFLUX n'ait pas été beaucoup plus efficace que l'itération précédente, dit Hell, son équipe a pu l'utiliser pour déduire une vitesse de marche pour la kinésine de 550 nanomètres par seconde et une longueur de foulée de 16 nanomètres à des concentrations d'ATP similaires à celles trouve dans les cellules vivantes. En marquant et en suivant différentes parties de la protéine, l'équipe a également montré que chaque foulée comprend deux sous-étapes de 8 nanomètres et que la tige d'une kinésine tourne lorsqu'elle se déplace, ce qui entraîne un mouvement vers l'avant qui tourne légèrement vers la droite. Les auteurs ont également découvert que l'ATP est absorbé lorsqu'un seul pied est lié au microtubule, mais qu'il est consommé lorsque les deux pieds sont liés, ce qui résout des résultats précédemment contradictoires7,8.

Ries et son équipe ont abordé le mouvement kinésine sous un angle différent. Ils ont utilisé un instrument commercial MINFLUX développé par Abberior, une société basée à Göttingen cofondée par Hell, pour suivre la protéine dans les cellules vivantes. L'environnement cellulaire encombré et en constante évolution signifie que le groupe s'est retrouvé avec moins de pistes, mais ils ont pu capturer les pas de côté, les décrochages et les sauts d'un microtubule à l'autre - tous les efforts de la protéine pour contourner les obstacles qui ne sont généralement pas vu dans des échantillons purifiés. "Sinon, nous voyons à peu près les mêmes choses : des vitesses de marche similaires, les mêmes tailles de pas", explique Ries. "Et c'était agréable de pouvoir les mesurer pour la première fois dans la cellule vivante."

William Hancock, ingénieur biomédical à la Pennsylvania State University du State College qui étudie la kinésine mais n'a participé à aucune des deux études, qualifie les études de "assez incroyables". Les résultats, note-t-il, correspondent en grande partie aux travaux antérieurs, dont la quasi-totalité avait été réalisée in vitro à l'aide de protéines motrices purifiées. "Nous obtenons nos réponses très précises là-bas, mais c'est bien de pouvoir extrapoler jusqu'à l'intérieur des cellules. C'est vraiment un tour de force."

Cela dit, force est de constater que MINFLUX "n'est pas encore à la limite de ses performances". Ayant atteint une résolution spatiale inférieure au nanomètre, un domaine où MINFLUX peut encore s'améliorer, dit-il, est sa performance temporelle. Les deux groupes ont travaillé avec des concentrations d'ATP allant jusqu'à un millimolaire, mais la cellule moyenne en contient plus de quatre fois plus.

Atteindre une résolution temporelle en temps réel dans ces conditions nécessitera de meilleurs systèmes de suivi, explique Luke Lavis, chimiste organique au campus de recherche Janelia du Howard Hughes Medical Institute à Ashburn, en Virginie, qui a développé les colorants utilisés dans l'étude de Ries. "Cette révolution dans l'imagerie à super-résolution met en évidence, si je peux dire cela, le fait que bon nombre des stratégies d'étiquetage et d'attachement que nous avons utilisées sont importantes", dit-il. "Le rêve pour nous tous est de pouvoir attacher un fluorophore à petite molécule à un endroit spécifique sur une protéine où le lieur n'est que quelques atomes." De nouveaux outils tels que l'expansion du code génétique, dans lequel des acides aminés synthétiques sont transformés en protéines pour faciliter le marquage, vont dans cette direction, ajoute-t-il, mais "ils sont loin d'être clé en main".

Pôle NatureTech

De telles avancées pourraient ouvrir de multiples voies de recherche, surtout si elles permettent aux chercheurs de suivre plusieurs protéines, ou plusieurs sites dans les protéines, à la fois. Cette année, les chercheurs ont introduit un outil appelé RESI (amélioration de la résolution par imagerie séquentielle), qui vise à faire exactement cela9. RESI peut étiqueter des copies adjacentes de la même molécule cible avec différentes étiquettes, permettant aux scientifiques de distinguer les molécules distantes de moins d'un nanomètre. Bien que RESI ne travaille actuellement que sur des molécules fixes ou stationnaires, la combinaison de ses découvertes avec les données de suivi MINFLUX sur des copies non fixées pourrait donner des résultats complémentaires sur l'arrangement et le mouvement d'une protéine.

Ries s'intéresse à l'étude d'autres protéines motrices et, dans une expérience supplémentaire partagée dans son article2, a appliqué MINFLUX à la protéine de contraction musculaire, la myosine. En 2019, Lavis a cofondé une entreprise pour utiliser le suivi d'une seule molécule pour le développement de médicaments. D'autres scientifiques ont suggéré tout, des facteurs de transcription et des protéines de liaison à l'ADN à la cohésine et à d'autres moteurs moléculaires, comme cibles d'études futures.

Mais Haley Marks, ingénieur biomédical et scientifique de projet au California NanoSystems Institute de l'Université de Californie à Los Angeles, affirme qu'il faudra du temps avant que MINFLUX ne devienne un système "plug-and-play" vraiment accessible et abordable. En attendant, suggère-t-elle, le MINFLUX pourrait profiter à la communauté au sens large en contribuant aux outils virtuels de super-résolution. Ces algorithmes d'intelligence artificielle s'entraînent sur de grandes collections d'images de microscopie pour apprendre à créer des images en super-résolution à partir d'images de microscopie conventionnelles. Les données qui en résultent, dit Marks, "sont beaucoup plus accessibles aux personnes qui ne peuvent pas se permettre un microscope de plusieurs millions de dollars".

doi : https://doi.org/10.1038/d41586-023-01906-0

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